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定點(diǎn)敲入小(大)鼠
技術(shù)原理簡(jiǎn)介
基因敲入(Knockin)鼠是指通過(guò)TALEN/CRISPR技術(shù)在目的序列位置引進(jìn)特定的突變或外源基因的小鼠。通過(guò)針對基因靶序列設計相應的打靶質(zhì)粒，然后根據需要插入的位置構建含Knockin片段或點(diǎn)突變的Donor質(zhì)粒，將Donor質(zhì)粒與打靶質(zhì)粒共同顯微注射進(jìn)小鼠的受精卵中，TALEN/CRISPR定位到基因組上的靶序列并切割雙鏈DNA，在隨后的修復過(guò)程中，細胞以含同源序列的Donor質(zhì)粒為模版修復基因組DNA，最終獲得在目的DNA序列插入Knockin片段的Knockin小鼠。比如將報告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)通過(guò)同源重組的方式引入目的基因的特定位點(diǎn)，從而跟蹤目標基因的表達；也可以用報告基因取代大小鼠本身的基因，即：KO/KI同時(shí)發(fā)生。
TALEN/CRISPR構建定點(diǎn)敲入小(大)鼠技術(shù)流程圖
服務(wù)流程及周期
服務(wù)流程及周期圖
| 步驟 | 內容 | 周期 |
| 敲入元件獲得 | 客戶(hù)提供或全基因合成 | 根據實(shí)際情況而定 |
| Cas9/gRNA的合成和同源模板(Donor)構建 | 合成Cas9/gRNA，檢測Cas9/gRNA活性，構建同源模板質(zhì)粒 | 2個(gè)月 |
| 得到Founder | Cas9/gRNA體外轉錄成mRNA和Donor質(zhì)粒共同顯微注射受精卵，胚胎移植到代孕母鼠子宮，3周后出生，2周齡基因型鑒定。 | 2-3個(gè)月 |
| 得到F1代雜合子 | 2個(gè)月后性成熟，Founder和野生型小鼠交配，3周后出生，2周齡基因型鑒定，獲得穩定傳代的基因突變雜合子F1代。 | 3-4個(gè)月 |
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