基于CRISPR/Cas9的高通量篩選

我們的策略是直接在功能上研究，通過(guò)gRNA敲除候選基因篩選得到功能基因。合成致死的靶基因，gRNA和藥物聯(lián)合使用可以篩選到能夠起耐藥作用的靶基因。這些數據為靶向治療和聯(lián)合用藥提供了重要依據?；趃RNA文庫的高通量篩選，可平行分析成千上萬(wàn)條基因功能，大大加快研究進(jìn)程，從而能迅速、詳盡地鑒定出細胞過(guò)程或信號傳導途徑的相關(guān)基因，以及疾病相關(guān)的藥物靶基因，保證研究成果更為系統和新穎。

基于慢病毒策略的單細胞篩選技術(shù)

1.  oligo用芯片方式合成，成本遠低于傳統化學(xué)方式。

2.  gRNA片段構建到慢病毒載體上，包裝成慢病毒混合文庫。

3.  通過(guò)控制病毒用量，盡量讓每個(gè)細胞被一個(gè)基因的一個(gè)靶點(diǎn)所作用。

4.  利用控制細胞存活，結合免疫染色、流式細胞術(shù)等手段得到篩選后的細胞。

5.  篩選得到的細胞使用通用引物PCR，二代測序分析，通過(guò)比對得到gRNA信息，從而推斷出起作用的靶基因。

成功案例

 已知藥物功能篩選其耐藥靶點(diǎn)

篩選策略：

1.   明確該藥物功能，明確該藥物的致死工作濃度。

2.  構建Cas9-gRNA慢病毒文庫。侵染細胞，構建整合Cas9-gRNA的細胞混合克隆。

3.  開(kāi)展篩選工作：高濃度藥物短期內持續作用細胞混合克隆，成活的細胞即為產(chǎn)生耐藥性的細胞，而產(chǎn)生耐藥性的原因是Cas9-gRNA導致的基因變異。

4.  存活的細胞通過(guò)二代測序，比對得到gRNA信息，從而推斷出起作用的基因靶點(diǎn)

成品文庫信息：

1.  人源CRISPR/Cas9-sgRNA慢病毒文庫：約21000個(gè)基因，每個(gè)基因對應6條gRNA。

慢病毒毒液，-80度儲存。

詢(xún)價(jià)。

參考文獻：

1.  ShalemO , Sanjana N E , Hartenian E , et al.Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells[J]. Science, 2014,343(6166):84-87.